Extracto

Combinado de orientación de la MAPK y PI3K vías de señalización en cáncer pueden ser necesarios para la actividad terapéutica óptima. Para apoyar los estudios clínicos de la terapia de combinación, 3'-desoxi-3 '- [
18 F] -fluorothymidine ([
18 F] -FLT) medido por la captación de Tomografía por Emisión de Positrones (PET) se evaluó como una manera no invasiva biomarcador respuesta sustituto en modelos preclínicos. La
vivo
de eficacia antitumoral en y PK-PD propiedades de la PD MEK inhibidor 0325901 y el inhibidor de PI3K GDC-0941, solo y en combinación, se evaluaron en HCT116 y HT29 xenoinjerto de cáncer de tumor-cojinete colorrectal humano ratones, y [
18 F] -FLT PET investigado en ratones portadores de xenoinjertos HCT116. La orientación dual de PI3K y MEK indujo inhibición del crecimiento tumoral marcada
in vivo
, y la actividad antitumoral fue predicho por [
18 F] de exploración PET -FLT después de 2 días de tratamiento. Farmacodinámico análisis utilizando la combinación del inhibidor de PI3K GDC-0941 y el PD inhibidor de MEK 0.325.901 reveló que el aumento de la eficacia se asocia con una inhibición mejorada de la fosforilación de ERK1 /2, S6 y 4EBP1, en comparación con la observada con cualquiera de los agentes solo, y mantenido la inhibición de la fosforilación de AKT. Los estudios farmacocinéticos indicaron que no hubo interacción PK marcada entre los dos fármacos. En conjunto, estos resultados indican que la combinación de inhibidores de PI3K y MEK puede resultar en una eficacia significativa, y demostrar por primera vez que [
18F] -FLT PET puede ser correlacionada con la eficacia mejorada del tratamiento con inhibidores de PI3K y MEK combinado.

Visto: Haagensen EJ, Thomas HD, Wilson I, Harnor SJ, SL Payne, Rennison T, et al. (2013) La mejorada
En Vivo
actividad de la combinación de un MEK y un inhibidor de PI3K se correlaciona con ratones [
18 F] -FLT PET en el cáncer humano de xenoinjerto de tumor colorrectal-cojinete. PLoS ONE 8 (12): e81763. doi: 10.1371 /

Editor journal.pone.0081763: Seema Singh, Universidad del Sur de Alabama Mitchell Cancer Institute, Estados Unidos de América

Recibido: 5 de Julio, 2013; Aceptado: 16 de octubre de 2013; Publicado: December 10, 2013

Derechos de Autor © 2013 Haagensen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. HDT, IW, SJH, SLP, TR, KMS, RJM y DRN son financiados por el Cancer Research Reino Unido (CRUK) el descubrimiento de medicamentos, por Imágenes y programas de formación de Química Médica (C240 /A15751 y C29821 /A10348) & amp; EJH era un (MRC) CASO Premio estudiante de doctorado del Consejo de Investigación Médica apoyada por UCB Celltech, Slough, Reino Unido. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:. Todos los autores declaran no tener ningún conflicto de interés relevante para el contenido de este documento con la excepción de David R. Newell, que está en la junta consultiva de Wilex Junta AG. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en el intercambio de datos y materiales de carta de presentación

Introducción

Numerosos inhibidores de moléculas pequeñas de las vías de transducción de señal específica se han desarrollado.; en particular, la vía PI3K, una vía principal de supervivencia, y de la vía MAPK, una vía mitogénica importante, se han dirigido en el cáncer. Sin embargo, la actividad clínica de agente único con estos inhibidores en general ha sido modesto, y por lo tanto se están evaluando las combinaciones [1]. Muchas combinaciones de inhibidores de PI3K y MAPK han mostrado actividad prometedora
in vitro en
pero algunos de los resultados más impresionantes se han visto
in vivo
.

Como agente único, la Pan inhibidor de PI3K GDC-0941 tiene modesta preclínica
in vivo
eficacia, con actividad dependiente de la dosis en el rango de 25-150 mg /kg /día en el modelo de xenoinjerto U87MG glioblastoma [2]. Posteriormente, las dosis de 75 a 150 mg /kg han demostrado que el resultado en la inhibición del crecimiento de tumores en una variedad de modelos de xenoinjertos de tumores humanos incluyendo los tumores que son
PIK3CA
mutante,
PTEN
null,
EGFR
tipo mutante o salvaje, con una disminución asociada en AKT y S6 fosforilación [2], [3], [4], [5], [6]. GDC-0941 muestra prometedor farmacocinética preclínicos con buena biodisponibilidad oral (78% en ratones), y sobre la base de estos datos y la farmacocinética previstos en los seres humanos [2], [7], está siendo sometido a la Fase I y II de los ensayos clínicos como una agente único o en combinación con agentes quimioterapéuticos [8], [9].

El PD inhibidor alostérico MEK 0.325.901 también mostraron una eficacia prometedora contra el cáncer preclínico selectivo
in vivo
como una sola agente, las dosis de 10-25 mg /kg que provoca una inhibición significativa del crecimiento tumoral y en muchos casos de regresión, en una gama de modelos murinos y de xenoinjertos de tumores humanos, incluyendo los
BRAF
o
KRAS
tipo salvaje o mutante [6], [10], [11], [12], [13], [14]. La inhibición del crecimiento alcanzado con altas dosis de PD 0325901 fue acompañado por una disminución en la fosforilación de ERK1 2 /, que se mantiene incluso cuando se utilizaron dosis más bajas de 1,5 a 3 mg /kg PD 0325901; sin embargo, estas dosis más bajas solamente fueron capaces de provocar un retraso en el crecimiento del tumor modesto [6], [10], [11], [12]. Oral y i.v. dosis de PD 0325901, se mostró a tener biodisponibilidad comparable, eran no tóxicos a & lt; 100 mg /kg, y resultó en una inhibición dependiente de la dosis de ERK1 /2 fosforilación en hígado de rata y de los pulmones debido a la inhibición de MEK [15]. Sin embargo, los ensayos clínicos revelan que un solo agente EP 0325901 se asoció con toxicidad ocular y neurológica, como la oclusión de la vena retiniana [16], y por lo tanto los ensayos clínicos utilizando como agente único EP 0325901 se han terminado [8].

el PD inhibidor de MEK 0325901 apareció prometedor como agente único, pero mostró toxicidad en ensayos clínicos, y la inhibición de crecimiento del tumor fue modesto con el inhibidor de PI3K GDC-0941 incluso en dosis altas, estos y otros inhibidores de PI3K y MEK ahora están siendo investigados clínicamente en combinación estudios [8]. Con este fin, la EP 0325901 se está estudiando en combinación con el inhibidor de PI3K /mTOR PF-04691502, y GDC-0941 está en un ensayo clínico en combinación con el inhibidor de MEK GDC-0973 [8].


In vivo
estudios pre-clínicos han demostrado que las combinaciones de inhibidores de PI3K y MEK resultado consistentemente en la inhibición del crecimiento tumoral mejorado en comparación con cualquiera de los agentes solo, y en muchos casos causa regresión en una variedad de xenoinjerto de tumor humano y en modelos tumorales de ratón con una gama de antecedentes genéticos, incluyendo aquellos con
KRAS
,
BRAF
y /o
PIK3CA
mutaciones, y /o
PTEN
supresiones [6 ], [12], [17], [18], [19]. Además, las respuestas observadas con el tratamiento de combinación eran a menudo durable, a pesar de dosis relativamente bajas de ambos inhibidores se utilizan en muchos estudios. La combinación de inhibidores de PI3K y MEK se ha demostrado que disminuye la fosforilación de S6, AKT y ERK1 /2 [12], [19], y los estudios de dosificación intermitente han revelado efectos prolongados sobre los marcadores de aguas abajo de la proliferación y la apoptosis, tales como una disminución sostenida en ciclina D1 y un aumento en los niveles de Bim, que puede ser responsable en parte de la mejora de la respuesta observada con la terapia de combinación [6], [19].

biomarcadores farmacodinámicos de MAPK y PI3K modulación vía, tales como los mencionados anteriormente, requieren repetidas biopsias invasivas y por lo tanto no puede ser clínicamente factible. Por otra parte, los cambios en el tamaño del tumor o estabilización de la enfermedad, medida por métodos de imagen volumétrica como la tomografía computarizada y la resonancia magnética, pueden no ser evidentes hasta después de muchas semanas de tratamiento, lo que puede retrasar la toma de decisiones clínicas y potencialmente resultar en pacientes inadecuadamente restante en ineficaces y tóxicos tratamientos para períodos prolongados de tiempo. Para hacer frente a las limitaciones de la proyección de imagen volumétrica convencional, la tomografía por emisión de positrones (PET) está siendo utilizado en estudios preclínicos y ensayos clínicos como un marcador biológico funcional sustituto imagen de respuesta [13], [14].

El flúor análogo de la timidina modificada, 3'-desoxi-3 '- [
18F] -fluorothymidine ([
18F] -FLT) se determina un radiotrazador PET que se utiliza para la detección de efectos anti-proliferativos, como la acumulación en las células por la expresión y la actividad de la enzima timidina quinasa 1 y transportadores de nucleósidos específicos, ambos de los cuales están bajo el control de los reguladores del ciclo celular de la fase S [13], [14], [20], [21], [22], [ ,,,0],23]. Además, la captación de [
18F] -FLT se ha demostrado que se correlaciona con marcadores de proliferación estándar, tales como Ki67, TK1 y la absorción de BrdU [24], [25], [26], [27], [28] , [29]. El uso de [
18F] -FLT PET, cambios en la proliferación en comparación con la línea de base se ha demostrado en una variedad de xenoinjertos de tumor humano tan pronto como 18, 24 y 120 horas utilizando cualquiera de los agentes solo GDC-0941 o PD 0325901 [13], [14], [30], [31]. Además, [
18 F] -FLT PET ya ha sido utilizado para predecir la eficacia de la quimioterapia y la radioterapia [32], [33], [34] y, recientemente, 2 ensayos clínicos han comenzado con el inhibidor de MEK AZD6244 como agente único la incorporación de [
18 F] -FLT PET [8], [35].

El objetivo de los estudios descritos en este informe era determinar si [
18 F] -FLT PET se puede utilizar como un biomarcador de respuesta sustituto para la terapia de MEK y combinado inhibidor de PI3K, como paso previo a los ensayos clínicos.

Métodos

Declaración de Ética

Todos los experimentos fueron revisados ​​y aprobados por la Universidad de Newcastle (Reino Unido) comité de bienestar de los animales, y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices para el bienestar y el uso de animales en la investigación del cáncer [36] y la legislación nacional, bajo licencia de proyecto (PPL60 /4442) emitido por el Ministerio del Interior del Gobierno del Reino Unido en virtud de los animales ( procedimiento científico) actuar 1986.

Líneas celulares & amp; Reactivos

células de cáncer colorrectal humano HCT116 y HT29 se obtuvieron de la ATCC (American Type Culture Collection). Todas las líneas celulares se cultivaron en medio RPMI-1640 (suplementado con 10% (suero v /v) fetal bovino, 1% (v /v) de penicilina (50 U /ml) - estreptomicina (50 mg /ml) y 2 mM L -glutamine) y fueron reconocidos exentos de contaminación por micoplasma mediante pruebas regulares con Mycoalert (Cambrex, Iowa, EE.UU.).

inhibidores

El inhibidor de MEK PD 0325901 fue proporcionado amablemente por UCB Celltech, Slough, Berkshire, Reino Unido. El inhibidor de PI3K GDC-0941 se sintetizó ya sea en la casa [37] o adquirido de Stratech Scientific Ltd., Newmarket, Suffolk, Reino Unido. Todos los lotes de GDC-0941 se caracterizaron completamente mediante análisis químico convencional, mostraron ser & gt; 99% de pureza, y generan resultados biológicos consistentes con la autenticidad del compuesto. Ambos fármacos se suspendieron en 0,5% de hidroxipropil-metilcelulosa (w /v) y 0,2% de Tween 80 (v /v) en agua destilada estéril (MCT).

Animales

Los estudios en animales eran todos llevado a cabo utilizando atímicos CD1 ratones desnudos hembra (Charles River, Kent, Reino Unido), implantado con HCT116 o HT29 xenoinjertos (1 × 10
7 células en 50 medios de comunicación l inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho), mantenido y manejado en aisladores bajo condiciones libres de patógenos específicos.

farmacocinético (PK) y farmacodinámico (PD) Estudios

ratones portadores de xenoinjertos de tumores humanos HCT116 fueron tratados con 1 mg /kg EP 0325901, 100 mg /kg GDC -0941 o la combinación de 1 mg /kg PD 0.325.901 y 100 mg /kg GDC-0941, y se extrajo sangre por punción cardiaca bajo anestesia terminal en tiempo seleccionado puntos de post-tratamiento (0.25-24 horas, 3 ratones /punto de tiempo). La sangre se recogió en tubos heparinizados, y el plasma se separó y se almacenó a -20 ° C hasta su análisis. Los tumores se retiraron, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C antes de PK y PD análisis, como se describe a continuación.

Para los análisis de PK, droga se extrajo a partir de 60 ml de alícuotas de las muestras por precipitación de proteínas con 9 volúmenes de acetonitrilo (MeCN). Las muestras se centrifugaron a 3000 g durante 5 minutos a 4 ° C, y 500 l del sobrenadante se evaporaron a sequedad bajo gas nitrógeno a 30 ° C usando un Zymark evaporador (Caliper Life Sciences Limited, Cheshire, Reino Unido). Las muestras se reconstituyeron en fase móvil 100 l HPLC que consta de 40% de acetonitrilo y 60% (v /v) pH 0,1% de ácido fórmico 4,0 (v /v), y 50 l del sobrenadante se aplica a una 10 cm Xterra Waters 186 000 436 C18 3,5 columna micras (Waters, Hertfordshire, UK) equipado con un filtro en línea. Los compuestos se eluyeron con la fase móvil anterior a 1 ml /min usando un sistema de cromatografía Waters Millennium (Waters, Hertfordshire, UK). Los analitos se detectaron por absorbancia UV a 275 y 315 nm, en tiempos de retención de 6.8-7.3 y 3.9-4.3 minutos para la EP 0325901 y GDC-0941, respectivamente. Para el análisis de drogas en el tejido tumoral, los tumores se homogeneizaron en 3 volúmenes de PBS (w /v) y 50 ml de alícuotas se extrajo con 9 volúmenes de MeCN, y se centrifuga, se evaporó y se analizaron como se ha descrito anteriormente. Total (libre y unido a proteínas) las concentraciones de fármaco se determinaron usando las curvas de calibración (0,1-10 g /ml, r
2 & gt; 0,98 en todos los casos) generado mediante la extracción de compuestos de la matriz apropiada, siendo & gt la eficacia de la extracción; 97% para todas las matrices. pruebas t pareadas se utilizaron para comparar los diferentes grupos de tratamiento y diferencias con un valor de p. & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa

Para los análisis de PD, los tumores (de 2 a 4~2.5 mm
3 unidades) fueron desglosados en 1 ml PhosphoSafe ™ reactivo de extracción (Merck Chemicals Ltd, Nottingham, Nottinghamshire, Reino Unido) que contiene un cóctel de inhibidores de proteasa (Pierce, Thermo Scientific, Rockford, Illinois, EE.UU.) a una dilución recomendada por el fabricante usando un Medimachine ™ (BD Biosciences, Oxford, Reino Unido), se centrifugó y se eliminó el sobrenadante y se analizó por transferencia Western. Las proteínas se resolvieron en NOVEX® 4-12% (w /w) geles de Tris-glicina (Invitrogen Ltd, Renfrew, Paisley, Reino Unido) y electrotransferred en Hybond C membrana de nitrocelulosa (GE Healthcare Life Sciences, Hatfield, Hertfordshire, Reino Unido). Las membranas se incubaron con fosfo-4EBP1 (Thr37 /46) (# 2855), fosfo-p44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) (# 4370), fosfo-Akt (Ser473) (# 4060) o la proteína ribosomal fosfo-S6 ( Ser235 /236) (# 4858) anticuerpos monoclonales obtenidos a partir de señalización celular Tecnología (New England Biolabs (UK) Ltd, Hitchin, Hertfordshire, Reino Unido). Unión de los anticuerpos se detectó por incubación con un anticuerpo policlonal de cabra anti-conejo conjugado con HRP (Dako, Glastrop, Dinamarca). Las transferencias fueron desarrolladas utilizando Pierce ECL (quimioluminiscencia potenciada) sustrato Western Blot (Thermo Scientific, Rockford, Illinois, EE.UU.), o sustrato duración prolongada SuperSignal® West Dura (Thermo Scientific, Rockford, Illinois, EE.UU.), y la película Kodak de rayos X ( Investigación genética Instrumentación Ltd, Braintree, Essex, Reino Unido) en un revelador de la película MediPhot 937 (Colenta, Weiner Neustadt, Austria), entonces digital explorado.

determinación de anticuerpos anti-tumor actividad

ratones portadores HCT116 o tumorales humanas HT29 xenoinjertos fueron asignados al azar en grupos de tratamiento para evitar cualquier sesgo y asegurar la coherencia entre los grupos, y luego tratados por sonda oral, ya sea con el vehículo MCT (10 ml /kg), 1 mg /kg EP 0325901, 100 mg /kg GDC-0941 o la combinación de 1 mg /kg PD 0.325.901 y 100 mg /kg GDC-0941 una vez al día durante 14 días. El volumen del tumor se controló por medición pinza usando la ecuación
a

2 ×
b
/2, donde
a
es la medida más pequeña y
b
el más grande. Los datos se presentan como la mediana de los volúmenes relativos de tumor (RTV), en los que se ha asignado el volumen del tumor en cada ratón en el día inicial del tratamiento (día 0) RTV un valor de 1. El tiempo para RTV3 y RTV4 para cada tumor individual fue calculada con base en un estándar punto a punto curva con 1000 segmentos utilizando el software GraphPad Prism (CA, EE.UU.). pruebas U de Mann Whitney se utilizaron para comparar los diferentes grupos, es decir, el control de
frente
cada grupo de tratamiento, los agentes individuales
frente
entre sí, y cada agente
frente a su
combinación. Las diferencias con un valor de p & lt; 0,05. Se consideraron estadísticamente significativos

[
18 F] -FLT Estudios PET

Antes del tratamiento y después de 2 días de tratamiento como se ha descrito anteriormente, ratones portadores humano HCT116 xenoinjertos tumorales (7-9 ratones /grupo) fueron anestesiados, cánulas en
a través de
su vena de la cola y se colocan en la posición boca abajo en una cama calentada a medida, que celebró tres ratones a la vez, dentro de un escáner PET MOSAICO (Philips, Eindhoven, NL). [
18 F] -FLT se obtuvo de PETNET (PETNET, Nottingham, Reino Unido), y los niveles de radiactividad se midió utilizando un contador de Capintec bien (Capintec, Nueva Jersey, EE.UU.). Aproximadamente el 10 MBq de -FLT [
18 F] se administró por vía intravenosa y se realizó una exploración PET dinámica de 1 hora, que consta de diez 1 minuto, seis de 5 minutos y dos marcos de tiempo de 10 minutos. Los ratones se recuperaron después de la digitalización y continuaron recibiendo tratamiento durante el resto del estudio. Los datos fueron analizados utilizando el software Imalytics (Philips, Aquisgrán, Alemania); una región 3D de interés se extrae todo el tumor y el valor de captación estándar (SUV) se calculó dividiendo la concentración de tejido (MBq /ml) por la dosis inyectada (MBq) /g de peso corporal. Los valores medios de SUV fueron entonces registrarse en tiempo, y se calculó el área bajo la curva (AUC) y el porcentaje de cambio en el área bajo la curva en relación con la exploración de línea de base. pruebas t pareadas se utilizaron para comparar el día 2
frente
los valores de AUC de línea de base de SUV para cada ratón individual dentro de cada grupo de tratamiento y las diferencias con un valor de p & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos

Resultados.

farmacocinética y farmacodinámica de inhibidores de PI3K y MEK, como agentes individuales y en combinación, en xenoinjertos de tumores humanos HCT116

Un estudio de dosis única PK /PD se ha realizado mediante el inhibidor de PI3K GDC-0941 y el inhibidor de MEK PD 0325901, como agentes individuales y en combinación, en ratones portadores de tumores de xenoinjertos-humano HCT116, durante un transcurso de tiempo de 0.25-24 horas. Las concentraciones de los fármacos en el plasma y el tejido del tumor se midieron utilizando HPLC (Figura 1 y Tabla 1). Las concentraciones de GDC-0941 y PD 0325901 en el plasma disminuyeron más de 24 horas después de una sola dosis de inhibidor (Figura 1). Un incremento de 10 veces en la GDC-0941 dosis, es decir, 100
frente
10 mg /kg, se alcanzaron valores del AUC en plasma que fueron 7 veces mayor. En el caso de la EP 0325901, un aumento de dosis comparables, es decir, 10
frente
1 mg /kg, se tradujo en un aumento de 15 veces en el AUC en plasma (Tabla 1). Las concentraciones de GDC-0941 y PD 0325901 en el tumor fueron más variables, y los niveles de PD 0325901 fueron indetectables en el plasma a las 24 horas (límite de detección: & lt; 100 nM) después del tratamiento con 1 mg /kg y en el tejido tumoral en todos los puntos de tiempo (límite de detección: & lt; 0,4 nmoles /g de material de tumor o & lt; 100 nM en homogeneizado de tumor diluyeron cuatro veces). Los valores de AUC tumor GDC-0941 (Tabla 1), indican que hubo un aumento de 15 veces en el AUC después de un aumento de 10 veces en la dosis.

Las concentraciones plasmáticas y tumorales del inhibidor de PI3K GDC-0941 (GDC ) (a) y el inhibidor de MEK PD 0325901 (PD) (B) medido por HPLC en las muestras de los ratones de xenoinjerto portadores de tumores HCT116 en los puntos de tiempo indicados después de una sola po dosis de ya sea 100 mg /kg GDC-0941 solo, 1 mg /kg PD 0325901 solo o la combinación de 1 mg /kg PD 0.325.901 y 100 mg /kg GDC-0941. Los datos se presentan como la concentración media de 3 ratones en cada grupo ± error estándar. La línea de trazos horizontal indica la
in vitro
GI
50 concentración (determinado previamente en [38]).

Curiosamente, los datos AUC plasmática sugiere que hay puede ser un modesto aumento en las concentraciones de PD 0325901 en el plasma después de la dosificación concomitante con GDC-0941 (Tabla 1), y, aunque esta diferencia fue limitada (2-3 veces), había una diferencia consistente y estadísticamente significativa entre la AUC de PD 0325901 cuando se dosifica solo en 1 o 10 mg /kg PD 0325901, o junto con 100 mg /kg GDC-0941 (p & lt; 0,01). administración GDC-0941 también parece tener un efecto sobre la retención de tumor de PD 0325901, en el que podría ser medida (es decir, después de 10 mg /kg PD 0325901), ya que de nuevo fue una diferencia estadísticamente significativa entre la AUC del tumor después de la dosificación con 10 mg /kg PD 0325901 sólo o junto con 100 mg /kg GDC-0941 (p = 0,01). Sin embargo, en contraste con los datos de plasma, concentraciones siguientes tumorales tratamiento, la combinación de ambos PD 0325901 y GDC-0941 fueron inferiores a las de un tratamiento de agente único, cuando se observó una diferencia significativa. Así, la actividad anti-tumor mejorada observada con la combinación de los inhibidores de MEK y PI3K (ver a continuación) no se debió a una interacción farmacocinética resulta en aumento de los niveles de fármaco tumor. En general, los datos farmacocinéticos demuestran que no hubo interacciones farmacocinéticas marcados (es decir, & gt; 3 veces el cambio en el AUC). Cuando GDC-0941 y PD 0325901 se dan en combinación

Después de una dosis única de 100 mg /kg GDC-0941, solo o en combinación con 1 mg /kg PD 0325901, las concentraciones de GDC-0941 en el plasma y el tejido tumoral superó consistentemente la de la
vitro
GI
50 valor en de 1081 nM (determinada previamente en [38]) más de 6 horas (Figura 1A). Del mismo modo, después de una sola dosis de 1 mg /kg PD 0325901, solo o en combinación con 100 mg /kg GDC-0941, las concentraciones de la EP 0325901 en el plasma superen sistemáticamente la de la
in vitro
GI
50 valor de 21 nM [38] en los primeros seis horas; sin embargo, los niveles fueron indetectables en el plasma a las 24 horas y en el tejido tumoral en todos los puntos de tiempo (Figura 1B). Sin embargo, como el límite de detección para la EP 0325901 en plasma (& lt; 100 nM) y el tejido tumoral (& lt; 0,4 nmoles /g) fue mayor que el
in vitro
GI
50 valor (21 nM), los datos de PK no indica necesariamente que no se alcanzaron las concentraciones de fármaco farmacológicamente activas

a pesar de que, a raíz de 1 mg /kg EP 0325901, las concentraciones estuvieron por debajo del límite de detección en el tumor (. & lt; 0,4 nmoles /g), esta dosis fue capaz de reducir (1 hora) y la ablación por completo (3 y 6 horas) la fosforilación de ERK1 /2, con muy poca recuperación por 24 horas. Como era de esperar, no hubo un efecto marcado de la EP 0325901 de AKT, S6 o fosforilación 4EBP1 (Figura 2A). GDC-0941 a 100 mg /kg fue suficiente para causar una reducción en la fosforilación de AKT, S6 y 4EBP1 en el transcurso de tiempo estudiado, aunque la reducción fue incompleta y el grado de inhibición varió dentro de los grupos (Figura 2B). Curiosamente, también hubo una reducción en la fosforilación de ERK1 /2 después de una dosis de 100 mg /kg GDC-0941. La combinación de 1 mg /kg PD 0.325.901 y 100 mg /kg GDC-0941 causó inhibición anterior completa de ERK1 /2 fosforilación, en comparación con el tratamiento con el agente único inhibidor de MEK, y una mayor inhibición de la S6 y 4EBP1 fosforilación en comparación con el tratamiento con el inhibidor de PI3K agente único (Figura 2C). Sin embargo, no hubo una diferencia marcada entre la inhibición de la fosforilación de AKT con la combinación en comparación con el tratamiento con inhibidores de PI3K agente único.

Efectos sobre las vías de transducción de señales de MAPK y PI3K /AKT después de xenoinjerto en ratones portadores de tumores HCT116 se trataron con una sola po dosis de 1 mg /kg de la PD MEK inhibidor 0.325.901 sola (A), 100 mg /kg del inhibidor de PI3K GDC-0941 solo (B) o la combinación de 1 mg /kg de la PD inhibidor de MEK 0325901 y 100 mg /kg del inhibidor de PI3K GDC-0941 (C). Después de 0.25-24 horas, los tumores se retiraron y los lisados ​​se sometieron a electroforesis, seguida por transferencia de Western usando el anticuerpo fosfo-específico indicado. Las transferencias fueron despojados y re-probaron con el anticuerpo de proteína total que corresponde a confirmar la igualdad de proteínas de carga. A-C representa las muestras de los tres ratones en cada grupo de tratamiento.

La eficacia de los inhibidores de PI3K y MEK, como agentes individuales y en combinación, en HCT116 y HT29 humano xenoinjertos tumorales

Con base en los resultados del estudio PK /PD, la eficacia de 100 mg /kg del inhibidor de PI3K GDC-0941 y 1 mg /kg de la PD inhibidor de MEK 0.325.901 administra por vía oral, como agentes únicos y en combinación, se evaluó en HCT116 y tumor humano HT29 xenoinjerto de ratones portadores (Figura 3). Las dosis individuales de los inhibidores de PI3K y MEK fueron elegidos para ser equi-activo, con el fin de reflejar los
in vitro
condiciones en las que la sinergia había sido previamente demostrada en estas líneas celulares [38]. En este estudio, los ratones se trataron diariamente durante 14 días y los volúmenes tumorales se midieron tres veces por semana. Las Figuras 3A y 3B demuestran que el tratamiento con 100 mg /kg GDC-0941 y 1 mg /kg PD 0325901, solo y en combinación, causada retraso del crecimiento tumoral en comparación con los tumores de control tratados con vehículo, y que el retraso del crecimiento fue mayor con la combinación. Además, el peso corporal se controló diariamente para evaluar la tolerabilidad de la terapia, y no se encontraron tratamientos tanto de agente único y de la combinación a ser no tóxico, es decir, los pesos corporales no caen por debajo de 90% del peso de partida (Figuras 3C y 3D).

HCT116 (A, C, e) y HT29 (B, D, F) xenoinjertos de tumor fueron tratados ya sea con el control del vehículo, 1 mg /kg del inhibidor de MEK PD 0.325.901 y 100 mg /kg de la PI3K inhibidor de la GDC-0941 solo, o 1 mg /kg del inhibidor de MEK PD 0.325.901 y 100 mg /kg del inhibidor de PI3K GDC-0941 en combinación, po una vez al día durante 14 días. [A-B] curvas de crecimiento del tumor: Los datos se presentan como el volumen tumoral relativo medio (RTV), donde se calcula el crecimiento de cada tumor con relación a su tamaño en el día 0. Los puntos representan la mediana de los 10 ratones en cada grupo. La línea de trazos muestra el punto en el que los tumores alcanzaron cuatro veces el volumen inicial (RTV4). [C-D] Efectos sobre el peso corporal: Los datos se presentan como porcentaje del peso inicial cuerpo. Los puntos representan la media de los 10 ratones en cada grupo ± error estándar. [E-F] Tiempo utilizado por los xenoinjertos para llegar a cuatro veces el volumen inicial (tiempo de RTV4): Los datos se presentan como el tiempo empleado por cada tumor individual en cada grupo para cuadruplicar su tamaño y líneas para representar la media de los ratones en cada grupo ± error estándar. Los valores de p se dan cuando la combinación es significativamente diferente de cualquier agente solo (p = 0.05).

Se calculó el tiempo para que los tumores cuadruplican en tamaño (tiempo para RTV4) (Figuras 3E y 3F y en la Tabla 2), y los análisis estadísticos utilizando una prueba de Mann-Whitney reveló que había una diferencia significativa entre los tumores tratados con vehículo de control y el grupo de combinación (p & lt; 0,01), y entre el único inhibidor de agente y los grupos de combinación (p ≤ 0.01), en ambos modelos de xenoinjerto de tumor HCT116 y HT29. Además, había una diferencia significativa entre los tumores tratados con vehículo de control y los inhibidores de agentes individuales en los xenoinjertos tumorales HCT116 (p & lt; 0,01), pero no en los xenoinjertos de tumor HT29 en el nivel de 5% (p = 0,06)
.

[
18 F] de exploración PET -FLT el día 2 como un biomarcador de respuesta sustituta de PI3K y MEK inhibidor de la eficacia como agentes individuales y en combinación en xenoinjertos de tumores humanos HCT116

la entrada ha sido propuesto que [
18F] -FLT PET se puede utilizar como un biomarcador sustituto de la respuesta del tumor a la terapia, y por lo tanto se llevaron a cabo estudios de PET dinámicas después de dos días de tratamiento, momento en el que no hubo diferencias significativas en el volumen del tumor entre el control o cualquiera de los grupos tratados. Por desgracia, [
18 F] captación -FLT por tumores HT29 era baja y este tumor no pudo ser utilizado para [
18 F] estudios -FLT PET. En contraste, los tumores HCT116 fueron [
18F] -FLT ávido y las Figuras 4A-C muestran que no hubo diferencias después de 2 días en [
18F] captación tumoral -FLT después del tratamiento con vehículo de control, 1 mg /kg PD 0325901 solo o 100 mg /kg GDC-0941 solo, en comparación con la línea base. Sin embargo, hubo una disminución significativa en [
18F] captación tumoral -FLT HCT116 después de 2 días de PI3K /MEK inhibidor de tratamiento de combinación (Figura 4D).

[A-D] xenoinjerto de tumor HCT116 [
captación 18F] -FLT sobre la exploración PET dinámica 1 hora a la línea de base y después del tratamiento, ya sea con el control del vehículo (a) 100 mg /kg del inhibidor de PI3K GDC-0941 solo (B), 1 mg /kg del inhibidor de MEK PD 0325901 solo (C) o la combinación de 1 mg /kg del inhibidor de MEK PD 0.325.901 y 100 mg /kg del inhibidor de PI3K GDC-0941 (D), po una vez al día durante 2 días. Los datos se presentan como el valor medio estandarizado de captación (SUV), donde la concentración en el tejido se calcula en relación a la dosis inyectada y el peso corporal. Los puntos representan la media de los ratones en cada grupo de 5 a 7 ± desviación estándar. [E] xenoinjerto Cambio porcentual del tumor HCT116 [
18 F] captación -FLT a 1 hora antes y después del tratamiento con el control del vehículo o la combinación de 1 mg /kg EP 0325901 y 100 mg /kg GDC-0941, p.o. una vez al día durante 2 días. Los datos se presentan como el porcentaje de cambio en el área bajo la curva (AUC) con relación a la correspondiente línea de base AUC, derivada de las figuras A-D, y las barras representan la media de los ratones en cada grupo de 5 a 7 ± error estándar. * Indica que el [
18F] -FLT SUV AUC en el grupo tratado combinación fueron significativamente diferentes después del tratamiento 2 días en comparación con la línea base (p & lt; 0,01).

Con base en los datos de las Figuras 4A-D, el porcentaje de cambio en el área bajo la [
18 F] -FLT SUV
frente
curva de tiempo (AUC) en tumores HCT116 se calculó para cada ratón individual. La figura 4E muestra que no hubo una diferencia significativa (p = 0,95) entre [
18 F] captación -FLT al inicio del estudio y después de 2 días de tratamiento en el control o con agente único EP 0325901- o ratones GDC-0941-tratada. En contraste, no hubo una disminución estadísticamente significativa de 18% en el tumor [
18F] captación -FLT después de 2 días en los ratones PI3K /MEK combinación inhibidor tratados (p & lt; 0,005). Estos datos demuestran que los cambios en [
18F] -FLT captación preceden efectos sobre el volumen del tumor, y que [
18F] -FLT PET es un biomarcador de respuesta temprana sustituto válido para la detección de la eficacia mejorada del inhibidor de PI3K y MEK combinado tratamiento.

Discusión

Con algunas excepciones notables, por ejemplo, imatinib en el tratamiento de la leucemia mieloide crónica y vemurafenib
BRAF
melanoma -mutant, la actividad clínica de agente único con terapias dirigidas es modesto, presumiblemente debido a la presencia de múltiples lesiones genéticas del conductor y el rápido desarrollo de los mecanismos de resistencia. Las combinaciones de terapias dirigidas son, por tanto, siendo ampliamente investigados. Sin embargo, en el desarrollo de combinaciones óptimas, la metodología del ensayo clínico convencional tiene limitaciones importantes como la gran cantidad de medicamentos, el número de pacientes requeridos y el tiempo necesario para la supervivencia de respuesta y criterios de valoración que se alcance se opone a la evaluación oportuna de todas las combinaciones posibles.